2026/7/18 23:00:09
Agent 级联失败防护：一个工具挂了不该拖垮整个会话
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酵母双杂交——核体系酵母双杂交技术背景酵母双杂交技术分为酵母核体系双杂交和酵母膜体系双杂交二者均作为研究蛋白-蛋白互作的工具具有简便、灵敏、可反映蛋白在活细胞内互作真实情况的特点现广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白相互作用的验证。酵母核体系双杂交原理其原理是Gal4转录因子由DNA结合域binding domainBD和转录激活域active domainAD组成二者可以分开独立表达为有功能的蛋白。当二者在物理空间上靠近时可以表现出完整的转录因子活性基于此把目的蛋白分别与BD、AD融合表达当目的蛋白发生互作时使得BD、AD在物理空间可以靠近这时就能够表现出完整的转录因子功能从而激活下游基因的表达。酵母双杂交应用检测一对已知蛋白的相互作用用已知功能的蛋白基因筛选cDNA文库寻找与其互作的结合蛋白进而解析其互作网络酵母双杂交优缺点优点采用高拷贝和强启动子的表达载体使目的蛋白过量表达方便复合物形成;筛选过程在真核酵母活细胞内进行一定程度上反映了体内的真实情况;文库来源广泛可采用不同组织、器官、细胞类型和特殊分化时期材料构建成cDNA文库缺点目前的酵母双杂交方法存在操作复杂假阳性和假阴性多结果主要为定性数据结果主要为定性数据不易精确判断蛋白质相互作用的强度等问题酵母双杂交结果需要再用其他方法进行进一步确认核体系双杂交载体系统核体系双杂交载体系统为pGBKT7pGADT7。核体系双杂交筛库中pGBKT7作为酵母双杂交bait表达载体能够表达Gal4 DNA结合结构域DNA-BD与bait蛋白质的融合蛋白。pGADT7作为酵母双杂交Prey表达载体能够表达Gal4激活结构域AD与目的蛋白质的融合蛋白。✅ pGBKT7载体主要元件Kan大肠杆菌筛选标签TRP1酵母营养缺陷筛选标签ADH1组成型启动子Gal4-BDGal4的DNA结合结构域pGBKT7载体图谱✅ pGADT7载体主要元件Amp大肠杆菌筛选标签LEU2酵母营养缺陷筛选标签ADH1组成型启动子Gal4-ADGal4的激活结构域pGADT7载体图谱酵母双杂交筛库流程以核体系为例核体系双杂交筛库案例展示1、载体构建将目的基因A构建到pGBKT7载体上形成诱饵克隆pGBKT7-A重组质粒。2、自激活检测将pGBKT7-ApGADT7质粒共转AH109从长出的酵母转化子随机随机挑取3个克隆点在SD-TL、SD-TLH、SD-TLHA、SD-TLHAX-α-gal平板上30℃培养3-5天。图1 自激活检测结果注为阳性对照pGBKT7-p53pGADT7-largeT-为阴性对照pGBKT7-laminCpGADT7-largeT另若诱饵基因有自激活活性可加3-AT抑制3-AT是酵母HIS3蛋白合成的竞争性抑制剂用于抑制HIS3基因的泄漏表达。通过梯度加3-AT观察在哪种浓度条件下自激活可被抑制后续背景筛选条件就为加有对应浓度3-AT的三缺培养基。3、文库筛选用含有正确pGBKT7-A诱饵质粒的AH109酵母菌株作为受体菌制备感受态将文库质粒转入其中涂SD-TLH筛选平板。30℃恒温培养3-7 d观察菌落生长。图2 筛库结果注为阳性对照pGBKT7-p53pGADT7-largeT筛库结果筛库的SD-TLH平板上长了96个单克隆菌落。阳性克隆鉴定为了鉴定SD-TLH平板中筛选到的96个阳性克隆分别是什么基因需要将这些阳性克隆从酵母细胞中扩增出来进行DNA测序并数据库中的序列进行BLAST比对分析。5、酵母阳性克隆回转验证将上述划线于SD-TLH缺陷型平板上长出的阳性克隆转化子分别用无菌水重悬后调整OD6000.2点至SD-TL、SD-TLH、SD-TLHX-α-gal、SD-TLHA和SD-TLHAX-α-gal缺陷平板30℃恒温培养3-4天。结果表明筛选得到的28个酵母阳性克隆均能在SD-TL、SD-TLH、SD-TLHX-α-gal、SD-TLHA和SD-TLHAX-α-gal缺陷平板上生长并能在SD-TLHX-α-gal、SD-TLHAX-α-gal缺陷平板上显蓝色。图3 回转验证结果注为阳性对照pGBKT7-p53pGADT7-largeT-为阴性对照pGBKT7-laminCpGADT7-largeT蓝色表格标注为该条件下可以生长的克隆白色表格标注为该条件下未生长的克隆核体系双杂一对一验证1、自激活验证验证目的基因有无自激活现象方法同筛库一样。2、互作验证将实验组pGBKT7-ApGADT7-B对照组pGBKT7pGADT7-B和pGBKT7-ApGADT7阳性对照pGBKT7-p53pGADT7-largeT阴性对照pGBKT7-laminCpGADT7-largeT已PCR验证的克隆分别用2 ml无菌ddH2O重悬调整OD600至0.2浓度设置为三个梯度100、10-1、10-2吸取10 ul做点板实验分别点于SD-TL、SD-TLH、SD-TLHX-α-gal、SD-TLHA、SD-TLHAX-α-gal的缺陷平板中30℃恒温培养3-5天。图4 互作检测结果注为阳性对照 pGBKT7-p53pGADT7-largeT-为阴性对照 pGBKT7-laminCpGADT7-largeT
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