)
Section.01什么是内参内参(Internal Control/Reference) 是指在科研实验中作为基准参照物的一类分子通常是蛋白质或 RNA。它们由管家基因编码在各种细胞或组织中恒定表达不受实验处理的影响。内参拥有两大核心特质稳定性强、丰度高。Section.02不加内参绝对不行内参并不是“凑数条带”没有规范内参的定量实验基本等于无效实验。作用一空白对照内参可作为空白对照评估实验全流程。基于内参稳定性强、丰度高且稳定的特性正常情况下内参是一定能跑出来的如果内参条带清晰、整齐说明你的样品处理、电泳、转膜、发光这些步骤都没问题。作用二校正误差实验中需要确保各个加样孔的蛋白上样量一致排除因加样体积偏差或蛋白定量不准导致的假阳性/假阴性。正常情况下显色后各个孔的内参条带在肉眼观察下宽度一致、灰度值(或荧光强度)相近这可直观表明每个泳道 (加样孔) 的总蛋白转膜量大致相同。若内参条带存在不清晰、缺失或深浅不一的情况说明实验本身存在问题需要先回溯排查实验步骤。图 1. 内参条带的校正作用[1]。注意校正看的是蛋白总质量不是上样体积体积一致 ≠ 上样量一致。作用三归一化定量肉眼看条带深浅只能叫“感觉有差异”不能叫“统计学差异”。所有正规 SCI 定量结果必须经过归一化(Normalize)校正WB 相对表达量 目的蛋白灰度值 ÷ 同泳道内参灰度值图 2. 肝组织中 ETV4 和 β-Actin 的蛋白水平统计数据为平均值[2]。当然部分文献的 WB 结果图下方还会附加一张柱状图纵坐标即为“相对灰度值”可以清晰直观地展示出实验组与对照组之间的表达差异。图 3. LOXL1 和 GAPDH 的蛋白水平统计数据为平均值[3]。Buttttt没有任何一款内参是完美的!内参并不是随便选一个就能用的。针对不同的实验条件、不同的组织样本以及不同的靶标蛋白内参的选择都有相应的讲究。Section.03如何根据自身实验选内参原则上内参的选择是要根据目的蛋白的分子量大小以及样本类型来定。分子量错开分子量最好相差 5 kDa 以上。内参与目的蛋白分子量太近条带会粘连、重叠无法单独抠灰度定量差距太大又会导致电泳分离过度不在同一张膜有效区间。相差 5 kDa 以上最稳妥。样本种属匹配哺乳动物细胞/组织 (如人、小鼠、大鼠) 可选择 GAPDH、β-Actin 等植物样本则选择 Plant Actin 等其他稀少物种参照已发表文献选择高度保守的管家基因表达蛋白作为内参。与实验条件适配首先要考虑的是你的实验处理是否影响内参例如某些特定的药物处理或缺氧实验可能会改变 GAPDH 的表达此时建议使用 β-Actin 。其次还要考虑目的蛋白的表达部位。例如核蛋白的内参要考虑用 Lamin ALamin BHistone H3 等膜蛋白的内参一般用 N-Cadherin。表 1. 不同表达部位常用内参。Section.04内参“锦囊”实验场景磷酸化蛋白检测磷酸化蛋白检测需使用双内参1. 常规内参作为实验体系的对照如 GAPDH 等。2.磷酸化蛋白对应的总蛋白如检测 p-Akt 时一定要同时检测 Total-Akt。 因为磷酸化蛋白条带变强弱可能是总蛋白量变了不是磷酸化水平变了需要用总蛋白进行校正。图 4. 不同处理条件下p-EGFR 与 Total-EGFR 表达的 WB 分析[4]。缺氧/诱导糖尿病等因素在进行缺氧或诱导糖尿病等处理时GAPDH 的表达水平会发生显著增高不适合作为内参[5]。 此时可按需选择使用 β-actin、α-Tubulin 或 Lamin B 做内参。1. 缺氧环境细胞在缺氧条件下为维持能量代谢会启动代偿机制来增强糖酵解途径。作为糖酵解的关键酶GAPDH 的表达量会被显著上调。图 5. 慢性缺氧条件下 (HX)GAPDH 表达量显著上调[5]。2. 诱导糖尿病在高糖环境或糖尿病模型中细胞的代谢途径特别是葡萄糖代谢发生剧烈改变直接影响 GAPDH 的代谢活性和表达水平。图 6. 对照组和糖尿病患者 (n 3) 胰腺组织蛋白 SOX9 和 NGN3 的 Western blot 结果[6]。此外部分抗癌和真菌药物处理时Tubulin 表达会受影响,不适合作为内参。Tubulin 是细胞骨架的主要成分而许多抗癌药物 (如紫杉醇、长春碱) 和抗真菌药物 (如灰黄霉素) 的作用机制正是通过靶向结合微管蛋白来干扰细胞分裂。因此这类药物处理会直接改变 Tubulin 的表达量或聚合状态导致其无法作为稳定的内参蛋白。此时可尝试选择 β-actin、GAPDH、Histone H3 或 Lamin B 做内参。细胞功能或状态变化1. 细胞增殖实验c-Jun 自身表达会变化不适合作为内参[9]。2. 凋亡实验TBP、Lamin 在凋亡过程中表达或定位会变化不适合作为核内参。图 9. 细胞凋亡 (细胞凋亡水平 RMHM) 对 TBP 表达量的影响[10]。组织特异性(1) 脂肪组织β-Actin 的表达量非常低不适合作为内参。(2) 多组织多细胞样本对比GAPDH 作为代谢类蛋白在活组织中表达比较恒定因此多组织多细胞样本对比时建议选用 GAPDH 作内参[11]。β-Actin 和 β-Tubulin 等结构蛋白在不同组织中会有表达差异。(3) 细胞骨架相关的蛋白研究不适合用 β-actin 作为内参因为细胞骨架的重组可能会影响 β-actin 的表达。特殊组织、样本的内参选择(1) 骨骼肌、心肌、平滑肌Tubulin 表达改变不适合作为内参。(2) 血浆、乳汁、组织液等分泌样本由于没有完整的细胞结构可选择分泌型蛋白如 Transferrin 作内参。下面是小 M 给大家整理汇总了常用内参建议一键收藏随时翻看~表 2. 常见内参选择汇总。Section.05小结总之科研路上无捷径内参选择亦是如此小 M 在这里提醒大家多查阅同领域、同实验条件的相关文献再用预实验把关用心做好每一步实验之路才能顺顺利利参考文献[1] Hou Y, et al. SMPDL3A is a cGAMP-degrading enzyme induced by LXR-mediated lipid metabolism to restrict cGAS-STING DNA sensing Immunity, 2023; 56, 2492-2507.e10[2] Xue X, et al. Hyodeoxycholic acid ameliorates cholestatic liver fibrosis by facilitating m6A-regulated expression of a novel anti-fibrotic target ETV4. J Hepatol. 2025 Jul;83(1):52-69.[3] Xuzhen Yan, et al. Selective inhibition of hepatic stellate cell and fibroblast-derived LOXL1 attenuates BDL- and Mdr2−/−-induced cholestatic liver fibrosis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology 2023 325:6.[4] Wang M, et al. Gefitinib and fostamatinib target EGFR and SYK to attenuate silicosis: a multi-omics study with drug exploration. Signal Transduct Target Ther. 2022 May 13;7(1):157.[5] Liu Q , et al. Danen EHJ, Le Dévédec SE. Differential response of luminal and basal breast cancer cells to acute and chronic hypoxia. Breast Cancer Res Treat. 2023 Apr;198(3):583-596.[6] Chen XY, et al. SDF-1 inhibits the dedifferentiation of islet β cells in hyperglycaemia by up-regulating FoxO1 via binding to CXCR4. J Cell Mol Med. 2022 Feb;26(3):750-763.[7] Wu X, et al. The small molecule CS1 inhibits mitosis and sister chromatid resolution in HeLa cells. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2018 May;1862(5):1134-1147.[8] 车迪, 等. 紫杉醇联合ipatasertib对口腔鳞状细胞癌细胞死亡、增殖及自噬的影响[J]. 《口腔颌面外科杂志》, 2025, 35(1): 28-33.[9] Wu Y, et al. Overexpression of Krüppel-Like Factor 4 Suppresses Migration and Invasion of Non-Small Cell Lung Cancer Through c-Jun-NH2-Terminal Kinase/Epithelial-Mesenchymal Transition Signaling Pathway. Front Pharmacol. 2020 Jan 8;10:1512.[10] Zhao J, et al. The novel lnc-HZ12 suppresses autophagy degradation of BBC3 by preventing its interactions with HSPA8 to induce trophoblast cell apoptosis. Autophagy. 2024 Oct;20(10):2255-2274.[11] Ren G, et al. Selection and validation of reference genes for qPCR analysis of differentiation and maturation of THP-1 cells into M1 macrophage-like cells. Immunol Cell Biol. 2022 Nov;100(10):822-829.
Section.01什么是内参内参(Internal Control/Reference) 是指在科研实验中作为基准参照物的一类分子通常是蛋白质或 RNA。它们由管家基因编码在各种细胞或组织中恒定表达不受实验处理的影响。内参拥有两大核心特质稳定性强、丰度高。Section.02不加内参绝对不行内参并不是“凑数条带”没有规范内参的定量实验基本等于无效实验。作用一空白对照内参可作为空白对照评估实验全流程。基于内参稳定性强、丰度高且稳定的特性正常情况下内参是一定能跑出来的如果内参条带清晰、整齐说明你的样品处理、电泳、转膜、发光这些步骤都没问题。作用二校正误差实验中需要确保各个加样孔的蛋白上样量一致排除因加样体积偏差或蛋白定量不准导致的假阳性/假阴性。正常情况下显色后各个孔的内参条带在肉眼观察下宽度一致、灰度值(或荧光强度)相近这可直观表明每个泳道 (加样孔) 的总蛋白转膜量大致相同。若内参条带存在不清晰、缺失或深浅不一的情况说明实验本身存在问题需要先回溯排查实验步骤。图 1. 内参条带的校正作用[1]。注意校正看的是蛋白总质量不是上样体积体积一致 ≠ 上样量一致。作用三归一化定量肉眼看条带深浅只能叫“感觉有差异”不能叫“统计学差异”。所有正规 SCI 定量结果必须经过归一化(Normalize)校正WB 相对表达量 目的蛋白灰度值 ÷ 同泳道内参灰度值图 2. 肝组织中 ETV4 和 β-Actin 的蛋白水平统计数据为平均值[2]。当然部分文献的 WB 结果图下方还会附加一张柱状图纵坐标即为“相对灰度值”可以清晰直观地展示出实验组与对照组之间的表达差异。图 3. LOXL1 和 GAPDH 的蛋白水平统计数据为平均值[3]。Buttttt没有任何一款内参是完美的!内参并不是随便选一个就能用的。针对不同的实验条件、不同的组织样本以及不同的靶标蛋白内参的选择都有相应的讲究。Section.03如何根据自身实验选内参原则上内参的选择是要根据目的蛋白的分子量大小以及样本类型来定。分子量错开分子量最好相差 5 kDa 以上。内参与目的蛋白分子量太近条带会粘连、重叠无法单独抠灰度定量差距太大又会导致电泳分离过度不在同一张膜有效区间。相差 5 kDa 以上最稳妥。样本种属匹配哺乳动物细胞/组织 (如人、小鼠、大鼠) 可选择 GAPDH、β-Actin 等植物样本则选择 Plant Actin 等其他稀少物种参照已发表文献选择高度保守的管家基因表达蛋白作为内参。与实验条件适配首先要考虑的是你的实验处理是否影响内参例如某些特定的药物处理或缺氧实验可能会改变 GAPDH 的表达此时建议使用 β-Actin 。其次还要考虑目的蛋白的表达部位。例如核蛋白的内参要考虑用 Lamin ALamin BHistone H3 等膜蛋白的内参一般用 N-Cadherin。表 1. 不同表达部位常用内参。Section.04内参“锦囊”实验场景磷酸化蛋白检测磷酸化蛋白检测需使用双内参1. 常规内参作为实验体系的对照如 GAPDH 等。2.磷酸化蛋白对应的总蛋白如检测 p-Akt 时一定要同时检测 Total-Akt。 因为磷酸化蛋白条带变强弱可能是总蛋白量变了不是磷酸化水平变了需要用总蛋白进行校正。图 4. 不同处理条件下p-EGFR 与 Total-EGFR 表达的 WB 分析[4]。缺氧/诱导糖尿病等因素在进行缺氧或诱导糖尿病等处理时GAPDH 的表达水平会发生显著增高不适合作为内参[5]。 此时可按需选择使用 β-actin、α-Tubulin 或 Lamin B 做内参。1. 缺氧环境细胞在缺氧条件下为维持能量代谢会启动代偿机制来增强糖酵解途径。作为糖酵解的关键酶GAPDH 的表达量会被显著上调。图 5. 慢性缺氧条件下 (HX)GAPDH 表达量显著上调[5]。2. 诱导糖尿病在高糖环境或糖尿病模型中细胞的代谢途径特别是葡萄糖代谢发生剧烈改变直接影响 GAPDH 的代谢活性和表达水平。图 6. 对照组和糖尿病患者 (n 3) 胰腺组织蛋白 SOX9 和 NGN3 的 Western blot 结果[6]。此外部分抗癌和真菌药物处理时Tubulin 表达会受影响,不适合作为内参。Tubulin 是细胞骨架的主要成分而许多抗癌药物 (如紫杉醇、长春碱) 和抗真菌药物 (如灰黄霉素) 的作用机制正是通过靶向结合微管蛋白来干扰细胞分裂。因此这类药物处理会直接改变 Tubulin 的表达量或聚合状态导致其无法作为稳定的内参蛋白。此时可尝试选择 β-actin、GAPDH、Histone H3 或 Lamin B 做内参。细胞功能或状态变化1. 细胞增殖实验c-Jun 自身表达会变化不适合作为内参[9]。2. 凋亡实验TBP、Lamin 在凋亡过程中表达或定位会变化不适合作为核内参。图 9. 细胞凋亡 (细胞凋亡水平 RMHM) 对 TBP 表达量的影响[10]。组织特异性(1) 脂肪组织β-Actin 的表达量非常低不适合作为内参。(2) 多组织多细胞样本对比GAPDH 作为代谢类蛋白在活组织中表达比较恒定因此多组织多细胞样本对比时建议选用 GAPDH 作内参[11]。β-Actin 和 β-Tubulin 等结构蛋白在不同组织中会有表达差异。(3) 细胞骨架相关的蛋白研究不适合用 β-actin 作为内参因为细胞骨架的重组可能会影响 β-actin 的表达。特殊组织、样本的内参选择(1) 骨骼肌、心肌、平滑肌Tubulin 表达改变不适合作为内参。(2) 血浆、乳汁、组织液等分泌样本由于没有完整的细胞结构可选择分泌型蛋白如 Transferrin 作内参。下面是小 M 给大家整理汇总了常用内参建议一键收藏随时翻看~表 2. 常见内参选择汇总。Section.05小结总之科研路上无捷径内参选择亦是如此小 M 在这里提醒大家多查阅同领域、同实验条件的相关文献再用预实验把关用心做好每一步实验之路才能顺顺利利参考文献[1] Hou Y, et al. SMPDL3A is a cGAMP-degrading enzyme induced by LXR-mediated lipid metabolism to restrict cGAS-STING DNA sensing Immunity, 2023; 56, 2492-2507.e10[2] Xue X, et al. Hyodeoxycholic acid ameliorates cholestatic liver fibrosis by facilitating m6A-regulated expression of a novel anti-fibrotic target ETV4. J Hepatol. 2025 Jul;83(1):52-69.[3] Xuzhen Yan, et al. Selective inhibition of hepatic stellate cell and fibroblast-derived LOXL1 attenuates BDL- and Mdr2−/−-induced cholestatic liver fibrosis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology 2023 325:6.[4] Wang M, et al. Gefitinib and fostamatinib target EGFR and SYK to attenuate silicosis: a multi-omics study with drug exploration. Signal Transduct Target Ther. 2022 May 13;7(1):157.[5] Liu Q , et al. Danen EHJ, Le Dévédec SE. Differential response of luminal and basal breast cancer cells to acute and chronic hypoxia. Breast Cancer Res Treat. 2023 Apr;198(3):583-596.[6] Chen XY, et al. SDF-1 inhibits the dedifferentiation of islet β cells in hyperglycaemia by up-regulating FoxO1 via binding to CXCR4. J Cell Mol Med. 2022 Feb;26(3):750-763.[7] Wu X, et al. The small molecule CS1 inhibits mitosis and sister chromatid resolution in HeLa cells. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2018 May;1862(5):1134-1147.[8] 车迪, 等. 紫杉醇联合ipatasertib对口腔鳞状细胞癌细胞死亡、增殖及自噬的影响[J]. 《口腔颌面外科杂志》, 2025, 35(1): 28-33.[9] Wu Y, et al. Overexpression of Krüppel-Like Factor 4 Suppresses Migration and Invasion of Non-Small Cell Lung Cancer Through c-Jun-NH2-Terminal Kinase/Epithelial-Mesenchymal Transition Signaling Pathway. Front Pharmacol. 2020 Jan 8;10:1512.[10] Zhao J, et al. The novel lnc-HZ12 suppresses autophagy degradation of BBC3 by preventing its interactions with HSPA8 to induce trophoblast cell apoptosis. Autophagy. 2024 Oct;20(10):2255-2274.[11] Ren G, et al. Selection and validation of reference genes for qPCR analysis of differentiation and maturation of THP-1 cells into M1 macrophage-like cells. Immunol Cell Biol. 2022 Nov;100(10):822-829.
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