scientific-agent-skills 实战指南bulk RNA-seq 上游手工流程Path B从 raw reads 到基因定量与 counts【免费下载链接】scientific-agent-skillsTurn any AI agent into an AI Scientist. The #1 Agent Skills library for science, used by 190,000 scientists worldwide. 165 ready-to-use validated skills plus 100 scientific databases covering biology, chemistry, medicine, and drug discovery. Compatible with Cursor, Claude Code, Codex, Pi, Antigravity, and the open Agent Skills standard.项目地址: https://gitcode.com/GitHub_Trending/cl/scientific-agent-skills导读本文完整讲解 bulk-rnaseq 技能中Path B — Standalone tools独立命令行工具路线的全套配方FastQC 原始数据质控 → fastp/Trim Galore 接头与低质量修剪 → STAR 基因组比对 Salmon decoy-aware 准比对 featureCounts 定量 → 链式strandedness判定 → MultiQC 汇总。当你想看到每一步发生了什么、手头只有少量样本、或无法使用 Nextflow/容器时这是一条与 nf-core/rnaseq 完全等价、可审计、可复现的 reads → quant 路线。读完后你将能独立完成从一份.fastq.gz到一张基因 × 样本 counts 矩阵的全部上游操作并理解为什么链式设定错误会悄悄丢掉一半 reads这类关键陷阱。本文以 references/upstream-manual.md 为主体骨架展开并结合 bulk-rnaseq 技能说明与仓库中的装配脚本 scripts/build_counts_matrix.py 补充实现级细节。上图展示了 bulk-rnaseq 技能的完整链路上游 raw FASTQ 经 FastQC/MultiQC 质控、STAR/Salmon可通过 nf-core/rnaseq定量为 counts.csv再交由 pydeseq2 做差异表达与 pathway-enrichment 富集。本文聚焦图中READS → COUNTS左侧部分的手工实现。一、选择 Path B 的判断标准与适用前提bulk-rnaseq 技能是路由器而非重新实现reads → counts 这一步提供了两条产出一致基因计数的路线。按照 SKILL.md 中的对比适合选Path B的场景是手头只有少量样本想逐一学习/检查每一步的中间产物没有可用的 Nextflow 或容器运行环境受约束环境需要跑管线没有暴露出来的非常规步骤希望每一步都有完整的透明度和可审计性。当样本量大、要上 HPC/云、或更看重一键式可复现与完整 MultiQC 报告时应优先走Path Anf-core/rnaseq见 references/upstream-nfcore.md。Path B 的核心前提是当工具、版本、参考基因组与参数一致时其结果与 Path A 等价因此务必以完全相同的设定定量每一个样本SKILL.md 明确将跨样本混用比对器/版本/参考/参数列为最常见的失败陷阱之一。两条路径最后汇合到同一张基因级 counts 矩阵之后的差异表达pydeseq2 技能与富集分析pathway-enrichment 技能流程完全相同。二、环境安装用 bioconda 一次性装上全套工具文档给出的安装方式是基于 Conda 的依赖管理conda create -n rnaseq -c bioconda -c conda-forge fastqc fastp trim-galore star2.7.11b salmon1.10.3 subread multiqc rseqc几个要点说明版本锁定是关键这里用star2.7.11b、salmon1.10.3双引号形式精确固定版本。bulk-rnaseq 技能把可辩护defensible定义为可复现锁定管线/工具版本、记录参数、固定随机种子 质量门控 统计严谨三者叠加未锁定的 latest 版本正是 SKILL.md 明确的 pitfall。star2.7.11b与salmon1.10.3分别是仓库中 SKILL.md 与文档共同引用的推荐版本Skill 的 Setup 一节给出了同一条conda create指令。工具分工fastqc质控、fastp/trim-galore修剪二选一、subread提供 featureCounts、multiqc汇总报告、rseqc提供infer_experiment.py判定链式。下游衔接时本技能的 Python胶水层还需要uv pip install pytximport pandas见 SKILL.md其中 pytximport 用于后续把 Salmon 转录本定量聚合到基因水平。运行前请把实际使用的版本号工具版本、参考基因组与注释 release记录下来——它们属于方法学Methods部分并直接决定分析是否可复现。三、参考数据准备Step 0每种生物你需要一份固定 releasepinned的注释版本下的两类文件基因组 FASTAgenome.fa 配对的注释 GTFannotation.gtf供 STAR 建索引与 featureCounts 计数使用转录组 FASTAtranscripts.fa即 cDNA供 Salmon 建索引使用。获取下载链接的方式文档推荐了两种使用仓库中的gget技能下载gget ref -w dna,gtf,cdna species或直接从 Ensembl / GENCODE 官网下载。重要约束基因组和 GTF 必须来自同一个 release——基因组与注释不匹配会导致比对率骤降或基因坐标错位这在 design-and-qc.md 中被列为比对率异常的首要怀疑对象。gget 的引用数据能力在 gget/SKILL.md 中有完整模块说明。四、Step 1原始 reads 质控FastQCmkdir -p qc/raw fastqc -t 8 -o qc/raw reads/*.fastq.gz-t 8使用 8 个线程并行处理多个文件-o qc/raw输出目录先mkdir -p建立reads/*.fastq.gzglob 一次传入全部样本。输出 HTML zip 报告中需要重点检查的四类指标详细阈值见同目录的 design-and-qc.mdPer-base sequence quality绝大多数碱基 ≥ Q30reads 末端质量下降属正常现象后续修剪或 STAR 的 soft-clip 会处理Adapter content接头含量若被标记异常说明存在接头需要进入第 2 步修剪Over-represented sequences过表达序列接头、rRNA 或高表达转录本。持续性 rRNA 信号提示文库 rRNA 去除不彻底Sequence duplication重复率RNA-seq 中高重复率是正常且可预期的高表达基因所致标准基因水平 DE 分析不要做去重见 design-and-qc.md 的 Dont deduplicate 专节。QC 解读与门控阈值的完整清单请参见同目录文档 design-and-qc.md。五、Step 2修剪——fastp推荐或 Trim Galore5.1 fastp推荐文档特别指出fastp 速度快并且会输出JSON/HTML 报告能被 MultiQC 直接识别汇总。mkdir -p trimmed fastp \ -i reads/s1_R1.fastq.gz -I reads/s1_R2.fastq.gz \ -o trimmed/s1_R1.fq.gz -O trimmed/s1_R2.fq.gz \ --detect_adapter_for_pe --qualified_quality_phred 20 --length_required 36 \ --thread 4 --json qc/s1.fastp.json --html qc/s1.fastp.html参数逐项说明参数作用-i/-I双端测序的 R1 / R2 输入-o/-O修剪后的 R1 / R2 输出输出扩展名建议与输入一致便于下游 glob--detect_adapter_for_pe对双端数据自动检测并切除接头--qualified_quality_phred 20碱基质量 ≥ Q20 才保留--length_required 36修剪后长度不足 36 bp 的 reads 丢弃--thread 44 线程--json/--html把 JSON/HTML 报告写到qc/供 MultiQC 聚合5.2 Trim Galore备选Trim Galore 内部封装 Cutadapt FastQC并能自动检测接头trim_galore --paired --cores 4 --fastqc -o trimmed reads/s1_R1.fastq.gz reads/s1_R2.fastq.gz--paired按双端模式修剪两端需保持配对--cores 44 个并行核心--fastqc修剪后立即自动跑一轮 FastQC省去手动复查-o trimmed输出目录。5.3 一个关键经验判断对于现代测序数据以及 STAR 比对STAR 本身会做 soft-clip 处理 reads 末端激进的低质量修剪通常没有必要去接头才是主要目标。修剪完成后务必在 trimmed reads 上重跑 FastQC确认接头已去除、质量分布已改善。六、Step 3aSTAR——基因组比对 基因计数6.1 建索引每套 基因组注释读长 只需一次STAR --runMode genomeGenerate --runThreadN 12 \ --genomeDir star_index \ --genomeFastaFiles genome.fa \ --sjdbGTFfile annotation.gtf \ --sjdbOverhang 100--runMode genomeGenerate索引构建模式--genomeDir star_index索引输出目录--genomeFastaFiles genome.fa--sjdbGTFfile annotation.gtf基因组序列 剪接注释--sjdbOverhang理论取读长 − 1如 150 bp 读长取 149100 是文档认可的安全默认值资源提示人类基因组约需30 GB RAM。6.2 比对并直接计数逐样本STAR --runThreadN 12 --genomeDir star_index \ --readFilesIn trimmed/s1_R1.fq.gz trimmed/s1_R2.fq.gz --readFilesCommand zcat \ --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \ --quantMode GeneCounts \ --outFileNamePrefix star/s1.--readFilesCommand zcat输入是 gz 压缩文件时的解压命令STAR 不支持直接读 gz--outSAMtype BAM SortedByCoordinate输出按坐标排序的 BAM供下游 RSeQC/IGV 查看或交给 featureCounts--quantMode GeneCounts在比对同时直接统计每个基因的 reads写出star/s1.ReadsPerGene.out.tab--outFileNamePrefix star/s1.所有输出以star/s1.为前缀。ReadsPerGene.out.tab共 4 列gene_id 后依次为 unstranded / forward / reverse 三种链式下的计数具体选哪一列取决于链式判定见下文专节。scripts/build_counts_matrix.py 在解析时正是跳过前 4 行汇总统计N_unmapped等再依据--strandedness选择列 1/2/3unstranded/forward/reverse该映射在脚本第 38 行STAR_STRAND_COL {unstranded: 1, forward: 2, reverse: 3}中可见。七、Step 3bSalmon——decoy-aware 准比对定量7.1 建 decoy-aware 索引Salmon 是不做全基因组比对的轻量定量工具直接比对到转录组。为了让来自未注释/基因组区域的 reads 不被错误地计数到转录本上必须构建带诱饵decoy的索引# 1. Decoys 基因组上所有序列名gentrome 转录组 后接 基因组顺序不能反 grep ^ genome.fa | sed s/^//; s/ .*// decoys.txt cat transcripts.fa genome.fa | gzip gentrome.fa.gz # 2. 建索引k31 适用于 75 bp 的 reads更短的 reads 用更小的 k salmon index -t gentrome.fa.gz -d decoys.txt -i salmon_index -k 31 -p 12decoys.txt中每一行是一个基因组 contig/染色体的名字取后第一个空格前的字段gentrome.fa.gz 转录组 FASTA 在前、基因组 FASTA 在后拼接后压缩顺序很重要salmon index -k 31k-mer 长度 31适用于 ≥75 bp 的 reads读长更短时应减小 k-p 1212 线程并行。7.2 逐样本定量salmon quant -i salmon_index -l A \ -1 trimmed/s1_R1.fq.gz -2 trimmed/s1_R2.fq.gz \ --gcBias --seqBias --validateMappings -p 8 \ -o quant/s1-l A让 Salmon 自动检测文库类型/链式见第八节--gcBias --seqBias开启 GC 偏好与序列偏好校正提高定量准确度--validateMappings对候选映射做校验降低假阳性-p 88 线程-o quant/s1每样本一个输出目录。每个quant/sample/quant.sf是转录本水平的结果需要聚合到基因水平——使用仓库的 scripts/build_counts_matrix.py --from salmon需要一个tx2gene映射表说明见 counts-and-handoff.md。定量完成后始终检查报告中的比对率quant/sample/logs/salmon_quant.log正常情况下应 70%比对率低通常意味着转录组选错、缺少 decoy 或存在污染design-and-qc.md 的对应 QC 门控。八、Step 3cfeatureCounts——从 STAR BAM 计数备选当你想基于 STAR 排序 BAM 统一计数而非用 STARGeneCounts的逐样本输出时使用 featureCounts。其优点是可以一次传入所有样本的 BAM 得到一张合并矩阵featureCounts -T 8 -p --countReadPairs \ -a annotation.gtf -g gene_id \ -s 2 \ # strandedness: 0 unstranded, 1 forward, 2 reverse -o counts/featurecounts.txt \ star/s1.Aligned.sortedByCoord.out.bam star/s2.Aligned.sortedByCoord.out.bam ...-T 88 线程-p --countReadPairs双端数据按 read pair片段计数而不是分别数两条单端 reads-a annotation.gtf -g gene_id注释与计数的基因属性attribute如需计数转录本可改-g transcript_id-s 2链式设定0非链式1正向2反向详见第九节-o counts/featurecounts.txt输出合并矩阵文件头含命令行记录实际表头在其后一行build_counts_matrix.py 用comment#读取真实表头再保留Geneid与各 BAM 计数列并清洗成样本名参数最后列出全部样本 BAM一次跑完得到一张矩阵。解析这张矩阵同样交给scripts/build_counts_matrix.py --from featurecounts。九、链式Strandedness——最容易做错、出错代价最大的一环错误链式设定会静默丢弃约一半 reads因此需要先判定一次再对所有工具一致使用。文档给出了两种判定方法Salmon-l A自动检测结果记录在quant/sample/lib_format_counts.json中——ISR 反向链式双端ISF 正向IU/IS 非链式RSeQC 工具判定对某个 STAR BAM 运行infer_experiment.py -r genes.bed -i s1.bam。判定结果到各工具的映射表这是原文档的核心表格务必全量继承LibrarySalmon-lfeatureCounts-sSTAR column在ReadsPerGene.out.tab中Unstranded非链式IUautoA0col 2Forward如 Ligation 建库ISFautoA1col 3Reverse如 dUTP/TruSeq 链式ISRautoA2col 4实用经验Illumina TruSeq Stranded mRNA最常见的试剂盒属于反向链式对应 featureCounts-s 2、STAR 第 4 列。拿不准时让 Salmon-l A自动检测其余工具与之对齐即可。该一致性约束同时也体现在下游装配中build_counts_matrix.py 在--from star模式下用--strandedness默认reverse决定读取哪一列也就是说上游 STAR 比对时若不确定链式只要比对的ReadsPerGene.out.tab四列都保留选择可推迟到建矩阵时。比对率异常偏低 unassigned_NoFeatures占比高往往是链式设错的最直接信号design-and-qc.md。十、Step 4MultiQC 汇总multiqc qc/ star/ quant/ counts/ -o qc/multiqc一条命令把 FastQC、fastp/Trim Galore、STAR、Salmon、featureCounts 的日志汇总成一份 HTML 报告。注意事项传入目录时 MultiQC 会递归搜索其中的可识别日志/报告JSON、HTML、Log.final.out、quant.sf元数据、featureCounts 输出等这份报告就是你 Methods 章节的QC 叙述QC narrative也是投稿/审稿时可辩护性的载体与 Path A 一样建议把它放在最先阅读的位置SKILL.md。至此 reads → counts 上游完成。接下来按 counts-and-handoff.md 构建 counts 矩阵并交给pydeseq2技能做差异表达。十一、从上游到 counts 矩阵与仓库装配脚本衔接Path B 手工产出的三种定量结果形态各异仓库用统一脚本 scripts/build_counts_matrix.py 收口见 SKILL.md# Salmon每样本 quant/sample/quant.sf tx2gene 映射表聚合到基因水平 python scripts/build_counts_matrix.py --from salmon \ --quant-dir quant/ --tx2gene tx2gene.tsv --output-dir counts/ # STAR --quantMode GeneCounts一个含多张 *.ReadsPerGene.out.tab 的目录 python scripts/build_counts_matrix.py --from star \ --quant-dir star/ --strandedness reverse --output-dir counts/ # featureCounts它写出的合并矩阵 python scripts/build_counts_matrix.py --from featurecounts \ --counts-file counts/featurecounts.txt --output-dir counts/脚本行为的几个源码级要点直接回扣本文的上游操作Salmon 分支build_counts_matrix.py自动发现*/quant.sf样本名 父目录名用 pytximport 以counts_from_abundancelength_scaled_tpm聚合——这是基因水平 DE 的正确选项能校正样本间的转录本长度/使用差异随后.round().astype(int)把估计计数取整因为 PyDESeq2 要求整数输入。整数的合理性论证见 counts-and-handoff.mdlength-scaled 后的取值可直接取整当作计数使用这也正是 nf-core 提供给下游的等价做法。STAR 分支跳过前 4 行汇总行按--strandedness选取列与本文第九节表格严格对应。featureCounts 分支保留Geneid与各 BAM 列并清洗为样本名。统一收口输出counts.csv基因 × 样本、整数并丢弃全零基因与metadata_template.csv每样本一行需填写condition/batch后交给 pydeseq2 技能约定矩阵保持基因 × 样本方向转置由下游 pydeseq2 加载器负责counts-and-handoff.md。上游 QC 环节出现的映射率/链式等问题在 DE 前还有最后一道防线对 counts 做 PCA 与样本距离热图检查design-and-qc.md 的 Post-quantification QC 一节确认生物学重复聚类、批次是否主导 PC1再进入差异表达。十二、全文速查清单与常见坑位Path B 全流程可按下表自查阶段命令要点关键输出注意0 参考数据gget ref / Ensembl / GENCODEgenome.fa、annotation.gtf、transcripts.fa基因组与 GTF 同 release1 FastQCfastqc -t 8 -o qc/raw reads/*.fq.gzHTML 报告检查接头/rRNA/质量分布2 fastp / Trim Galore见第五节trimmed/*.fq.gz JSON去接头为主勿过度修剪3a STARindex → align --quantMode GeneCountsBAM ReadsPerGene.out.tab--sjdbOverhang读长−1人源 ~30GB RAM3b Salmondecoy index →salmon quant -l Aquant/ /quant.sfgentrome 顺序、k 与读长匹配、查 mapping rate3c featureCounts一次传入全部 BAMfeaturecounts.txt-s与链式一致链式判定Salmon lib_format / RSeQCISR/ISF/IUTruSeq 链式 reverse所有工具对齐4 MultiQCmultiqc qc/ star/ quant/ counts/一份 HTML作为 Methods 的 QC 叙述收口build_counts_matrix.pycounts.csv metadata_template.csv保持基因 × 样本、取整、交由 pydeseq2结合 SKILL.md 的 Common PitfallsPath B 手工执行时最容易翻车的坑是链式设错静默丢一半 reads、不同样本混用比对器/版本/参数与 Path B 逐样本手动执行的特性高度相关、参考/版本未锁定导致结果不可复现以及把 TPM/FPKM 喂给 DESeq2——DESeq2 需要 raw或 length-scaled整数计数装配脚本与取整约定正是为此设计。若需要设计阶段的补课重复数 ≥3、批次与条件勿混杂、设计公式写法请回到 design-and-qc.md若样本量大且想一键复现则应改用 upstream-nfcore.md 描述的 Path A。【免费下载链接】scientific-agent-skillsTurn any AI agent into an AI Scientist. The #1 Agent Skills library for science, used by 190,000 scientists worldwide. 165 ready-to-use validated skills plus 100 scientific databases covering biology, chemistry, medicine, and drug discovery. Compatible with Cursor, Claude Code, Codex, Pi, Antigravity, and the open Agent Skills standard.项目地址: https://gitcode.com/GitHub_Trending/cl/scientific-agent-skills创作声明：本文部分内容由AI辅助生成（AIGC），仅供参考
scientific-agent-skills 实战指南bulk RNA-seq 上游手工流程Path B从 raw reads 到基因定量与 counts【免费下载链接】scientific-agent-skillsTurn any AI agent into an AI Scientist. The #1 Agent Skills library for science, used by 190,000 scientists worldwide. 165 ready-to-use validated skills plus 100 scientific databases covering biology, chemistry, medicine, and drug discovery. Compatible with Cursor, Claude Code, Codex, Pi, Antigravity, and the open Agent Skills standard.项目地址: https://gitcode.com/GitHub_Trending/cl/scientific-agent-skills导读本文完整讲解 bulk-rnaseq 技能中Path B — Standalone tools独立命令行工具路线的全套配方FastQC 原始数据质控 → fastp/Trim Galore 接头与低质量修剪 → STAR 基因组比对 Salmon decoy-aware 准比对 featureCounts 定量 → 链式strandedness判定 → MultiQC 汇总。当你想看到每一步发生了什么、手头只有少量样本、或无法使用 Nextflow/容器时这是一条与 nf-core/rnaseq 完全等价、可审计、可复现的 reads → quant 路线。读完后你将能独立完成从一份.fastq.gz到一张基因 × 样本 counts 矩阵的全部上游操作并理解为什么链式设定错误会悄悄丢掉一半 reads这类关键陷阱。本文以 references/upstream-manual.md 为主体骨架展开并结合 bulk-rnaseq 技能说明与仓库中的装配脚本 scripts/build_counts_matrix.py 补充实现级细节。上图展示了 bulk-rnaseq 技能的完整链路上游 raw FASTQ 经 FastQC/MultiQC 质控、STAR/Salmon可通过 nf-core/rnaseq定量为 counts.csv再交由 pydeseq2 做差异表达与 pathway-enrichment 富集。本文聚焦图中READS → COUNTS左侧部分的手工实现。一、选择 Path B 的判断标准与适用前提bulk-rnaseq 技能是路由器而非重新实现reads → counts 这一步提供了两条产出一致基因计数的路线。按照 SKILL.md 中的对比适合选Path B的场景是手头只有少量样本想逐一学习/检查每一步的中间产物没有可用的 Nextflow 或容器运行环境受约束环境需要跑管线没有暴露出来的非常规步骤希望每一步都有完整的透明度和可审计性。当样本量大、要上 HPC/云、或更看重一键式可复现与完整 MultiQC 报告时应优先走Path Anf-core/rnaseq见 references/upstream-nfcore.md。Path B 的核心前提是当工具、版本、参考基因组与参数一致时其结果与 Path A 等价因此务必以完全相同的设定定量每一个样本SKILL.md 明确将跨样本混用比对器/版本/参考/参数列为最常见的失败陷阱之一。两条路径最后汇合到同一张基因级 counts 矩阵之后的差异表达pydeseq2 技能与富集分析pathway-enrichment 技能流程完全相同。二、环境安装用 bioconda 一次性装上全套工具文档给出的安装方式是基于 Conda 的依赖管理conda create -n rnaseq -c bioconda -c conda-forge fastqc fastp trim-galore star2.7.11b salmon1.10.3 subread multiqc rseqc几个要点说明版本锁定是关键这里用star2.7.11b、salmon1.10.3双引号形式精确固定版本。bulk-rnaseq 技能把可辩护defensible定义为可复现锁定管线/工具版本、记录参数、固定随机种子 质量门控 统计严谨三者叠加未锁定的 latest 版本正是 SKILL.md 明确的 pitfall。star2.7.11b与salmon1.10.3分别是仓库中 SKILL.md 与文档共同引用的推荐版本Skill 的 Setup 一节给出了同一条conda create指令。工具分工fastqc质控、fastp/trim-galore修剪二选一、subread提供 featureCounts、multiqc汇总报告、rseqc提供infer_experiment.py判定链式。下游衔接时本技能的 Python胶水层还需要uv pip install pytximport pandas见 SKILL.md其中 pytximport 用于后续把 Salmon 转录本定量聚合到基因水平。运行前请把实际使用的版本号工具版本、参考基因组与注释 release记录下来——它们属于方法学Methods部分并直接决定分析是否可复现。三、参考数据准备Step 0每种生物你需要一份固定 releasepinned的注释版本下的两类文件基因组 FASTAgenome.fa 配对的注释 GTFannotation.gtf供 STAR 建索引与 featureCounts 计数使用转录组 FASTAtranscripts.fa即 cDNA供 Salmon 建索引使用。获取下载链接的方式文档推荐了两种使用仓库中的gget技能下载gget ref -w dna,gtf,cdna species或直接从 Ensembl / GENCODE 官网下载。重要约束基因组和 GTF 必须来自同一个 release——基因组与注释不匹配会导致比对率骤降或基因坐标错位这在 design-and-qc.md 中被列为比对率异常的首要怀疑对象。gget 的引用数据能力在 gget/SKILL.md 中有完整模块说明。四、Step 1原始 reads 质控FastQCmkdir -p qc/raw fastqc -t 8 -o qc/raw reads/*.fastq.gz-t 8使用 8 个线程并行处理多个文件-o qc/raw输出目录先mkdir -p建立reads/*.fastq.gzglob 一次传入全部样本。输出 HTML zip 报告中需要重点检查的四类指标详细阈值见同目录的 design-and-qc.mdPer-base sequence quality绝大多数碱基 ≥ Q30reads 末端质量下降属正常现象后续修剪或 STAR 的 soft-clip 会处理Adapter content接头含量若被标记异常说明存在接头需要进入第 2 步修剪Over-represented sequences过表达序列接头、rRNA 或高表达转录本。持续性 rRNA 信号提示文库 rRNA 去除不彻底Sequence duplication重复率RNA-seq 中高重复率是正常且可预期的高表达基因所致标准基因水平 DE 分析不要做去重见 design-and-qc.md 的 Dont deduplicate 专节。QC 解读与门控阈值的完整清单请参见同目录文档 design-and-qc.md。五、Step 2修剪——fastp推荐或 Trim Galore5.1 fastp推荐文档特别指出fastp 速度快并且会输出JSON/HTML 报告能被 MultiQC 直接识别汇总。mkdir -p trimmed fastp \ -i reads/s1_R1.fastq.gz -I reads/s1_R2.fastq.gz \ -o trimmed/s1_R1.fq.gz -O trimmed/s1_R2.fq.gz \ --detect_adapter_for_pe --qualified_quality_phred 20 --length_required 36 \ --thread 4 --json qc/s1.fastp.json --html qc/s1.fastp.html参数逐项说明参数作用-i/-I双端测序的 R1 / R2 输入-o/-O修剪后的 R1 / R2 输出输出扩展名建议与输入一致便于下游 glob--detect_adapter_for_pe对双端数据自动检测并切除接头--qualified_quality_phred 20碱基质量 ≥ Q20 才保留--length_required 36修剪后长度不足 36 bp 的 reads 丢弃--thread 44 线程--json/--html把 JSON/HTML 报告写到qc/供 MultiQC 聚合5.2 Trim Galore备选Trim Galore 内部封装 Cutadapt FastQC并能自动检测接头trim_galore --paired --cores 4 --fastqc -o trimmed reads/s1_R1.fastq.gz reads/s1_R2.fastq.gz--paired按双端模式修剪两端需保持配对--cores 44 个并行核心--fastqc修剪后立即自动跑一轮 FastQC省去手动复查-o trimmed输出目录。5.3 一个关键经验判断对于现代测序数据以及 STAR 比对STAR 本身会做 soft-clip 处理 reads 末端激进的低质量修剪通常没有必要去接头才是主要目标。修剪完成后务必在 trimmed reads 上重跑 FastQC确认接头已去除、质量分布已改善。六、Step 3aSTAR——基因组比对 基因计数6.1 建索引每套 基因组注释读长 只需一次STAR --runMode genomeGenerate --runThreadN 12 \ --genomeDir star_index \ --genomeFastaFiles genome.fa \ --sjdbGTFfile annotation.gtf \ --sjdbOverhang 100--runMode genomeGenerate索引构建模式--genomeDir star_index索引输出目录--genomeFastaFiles genome.fa--sjdbGTFfile annotation.gtf基因组序列 剪接注释--sjdbOverhang理论取读长 − 1如 150 bp 读长取 149100 是文档认可的安全默认值资源提示人类基因组约需30 GB RAM。6.2 比对并直接计数逐样本STAR --runThreadN 12 --genomeDir star_index \ --readFilesIn trimmed/s1_R1.fq.gz trimmed/s1_R2.fq.gz --readFilesCommand zcat \ --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \ --quantMode GeneCounts \ --outFileNamePrefix star/s1.--readFilesCommand zcat输入是 gz 压缩文件时的解压命令STAR 不支持直接读 gz--outSAMtype BAM SortedByCoordinate输出按坐标排序的 BAM供下游 RSeQC/IGV 查看或交给 featureCounts--quantMode GeneCounts在比对同时直接统计每个基因的 reads写出star/s1.ReadsPerGene.out.tab--outFileNamePrefix star/s1.所有输出以star/s1.为前缀。ReadsPerGene.out.tab共 4 列gene_id 后依次为 unstranded / forward / reverse 三种链式下的计数具体选哪一列取决于链式判定见下文专节。scripts/build_counts_matrix.py 在解析时正是跳过前 4 行汇总统计N_unmapped等再依据--strandedness选择列 1/2/3unstranded/forward/reverse该映射在脚本第 38 行STAR_STRAND_COL {unstranded: 1, forward: 2, reverse: 3}中可见。七、Step 3bSalmon——decoy-aware 准比对定量7.1 建 decoy-aware 索引Salmon 是不做全基因组比对的轻量定量工具直接比对到转录组。为了让来自未注释/基因组区域的 reads 不被错误地计数到转录本上必须构建带诱饵decoy的索引# 1. Decoys 基因组上所有序列名gentrome 转录组 后接 基因组顺序不能反 grep ^ genome.fa | sed s/^//; s/ .*// decoys.txt cat transcripts.fa genome.fa | gzip gentrome.fa.gz # 2. 建索引k31 适用于 75 bp 的 reads更短的 reads 用更小的 k salmon index -t gentrome.fa.gz -d decoys.txt -i salmon_index -k 31 -p 12decoys.txt中每一行是一个基因组 contig/染色体的名字取后第一个空格前的字段gentrome.fa.gz 转录组 FASTA 在前、基因组 FASTA 在后拼接后压缩顺序很重要salmon index -k 31k-mer 长度 31适用于 ≥75 bp 的 reads读长更短时应减小 k-p 1212 线程并行。7.2 逐样本定量salmon quant -i salmon_index -l A \ -1 trimmed/s1_R1.fq.gz -2 trimmed/s1_R2.fq.gz \ --gcBias --seqBias --validateMappings -p 8 \ -o quant/s1-l A让 Salmon 自动检测文库类型/链式见第八节--gcBias --seqBias开启 GC 偏好与序列偏好校正提高定量准确度--validateMappings对候选映射做校验降低假阳性-p 88 线程-o quant/s1每样本一个输出目录。每个quant/sample/quant.sf是转录本水平的结果需要聚合到基因水平——使用仓库的 scripts/build_counts_matrix.py --from salmon需要一个tx2gene映射表说明见 counts-and-handoff.md。定量完成后始终检查报告中的比对率quant/sample/logs/salmon_quant.log正常情况下应 70%比对率低通常意味着转录组选错、缺少 decoy 或存在污染design-and-qc.md 的对应 QC 门控。八、Step 3cfeatureCounts——从 STAR BAM 计数备选当你想基于 STAR 排序 BAM 统一计数而非用 STARGeneCounts的逐样本输出时使用 featureCounts。其优点是可以一次传入所有样本的 BAM 得到一张合并矩阵featureCounts -T 8 -p --countReadPairs \ -a annotation.gtf -g gene_id \ -s 2 \ # strandedness: 0 unstranded, 1 forward, 2 reverse -o counts/featurecounts.txt \ star/s1.Aligned.sortedByCoord.out.bam star/s2.Aligned.sortedByCoord.out.bam ...-T 88 线程-p --countReadPairs双端数据按 read pair片段计数而不是分别数两条单端 reads-a annotation.gtf -g gene_id注释与计数的基因属性attribute如需计数转录本可改-g transcript_id-s 2链式设定0非链式1正向2反向详见第九节-o counts/featurecounts.txt输出合并矩阵文件头含命令行记录实际表头在其后一行build_counts_matrix.py 用comment#读取真实表头再保留Geneid与各 BAM 计数列并清洗成样本名参数最后列出全部样本 BAM一次跑完得到一张矩阵。解析这张矩阵同样交给scripts/build_counts_matrix.py --from featurecounts。九、链式Strandedness——最容易做错、出错代价最大的一环错误链式设定会静默丢弃约一半 reads因此需要先判定一次再对所有工具一致使用。文档给出了两种判定方法Salmon-l A自动检测结果记录在quant/sample/lib_format_counts.json中——ISR 反向链式双端ISF 正向IU/IS 非链式RSeQC 工具判定对某个 STAR BAM 运行infer_experiment.py -r genes.bed -i s1.bam。判定结果到各工具的映射表这是原文档的核心表格务必全量继承LibrarySalmon-lfeatureCounts-sSTAR column在ReadsPerGene.out.tab中Unstranded非链式IUautoA0col 2Forward如 Ligation 建库ISFautoA1col 3Reverse如 dUTP/TruSeq 链式ISRautoA2col 4实用经验Illumina TruSeq Stranded mRNA最常见的试剂盒属于反向链式对应 featureCounts-s 2、STAR 第 4 列。拿不准时让 Salmon-l A自动检测其余工具与之对齐即可。该一致性约束同时也体现在下游装配中build_counts_matrix.py 在--from star模式下用--strandedness默认reverse决定读取哪一列也就是说上游 STAR 比对时若不确定链式只要比对的ReadsPerGene.out.tab四列都保留选择可推迟到建矩阵时。比对率异常偏低 unassigned_NoFeatures占比高往往是链式设错的最直接信号design-and-qc.md。十、Step 4MultiQC 汇总multiqc qc/ star/ quant/ counts/ -o qc/multiqc一条命令把 FastQC、fastp/Trim Galore、STAR、Salmon、featureCounts 的日志汇总成一份 HTML 报告。注意事项传入目录时 MultiQC 会递归搜索其中的可识别日志/报告JSON、HTML、Log.final.out、quant.sf元数据、featureCounts 输出等这份报告就是你 Methods 章节的QC 叙述QC narrative也是投稿/审稿时可辩护性的载体与 Path A 一样建议把它放在最先阅读的位置SKILL.md。至此 reads → counts 上游完成。接下来按 counts-and-handoff.md 构建 counts 矩阵并交给pydeseq2技能做差异表达。十一、从上游到 counts 矩阵与仓库装配脚本衔接Path B 手工产出的三种定量结果形态各异仓库用统一脚本 scripts/build_counts_matrix.py 收口见 SKILL.md# Salmon每样本 quant/sample/quant.sf tx2gene 映射表聚合到基因水平 python scripts/build_counts_matrix.py --from salmon \ --quant-dir quant/ --tx2gene tx2gene.tsv --output-dir counts/ # STAR --quantMode GeneCounts一个含多张 *.ReadsPerGene.out.tab 的目录 python scripts/build_counts_matrix.py --from star \ --quant-dir star/ --strandedness reverse --output-dir counts/ # featureCounts它写出的合并矩阵 python scripts/build_counts_matrix.py --from featurecounts \ --counts-file counts/featurecounts.txt --output-dir counts/脚本行为的几个源码级要点直接回扣本文的上游操作Salmon 分支build_counts_matrix.py自动发现*/quant.sf样本名 父目录名用 pytximport 以counts_from_abundancelength_scaled_tpm聚合——这是基因水平 DE 的正确选项能校正样本间的转录本长度/使用差异随后.round().astype(int)把估计计数取整因为 PyDESeq2 要求整数输入。整数的合理性论证见 counts-and-handoff.mdlength-scaled 后的取值可直接取整当作计数使用这也正是 nf-core 提供给下游的等价做法。STAR 分支跳过前 4 行汇总行按--strandedness选取列与本文第九节表格严格对应。featureCounts 分支保留Geneid与各 BAM 列并清洗为样本名。统一收口输出counts.csv基因 × 样本、整数并丢弃全零基因与metadata_template.csv每样本一行需填写condition/batch后交给 pydeseq2 技能约定矩阵保持基因 × 样本方向转置由下游 pydeseq2 加载器负责counts-and-handoff.md。上游 QC 环节出现的映射率/链式等问题在 DE 前还有最后一道防线对 counts 做 PCA 与样本距离热图检查design-and-qc.md 的 Post-quantification QC 一节确认生物学重复聚类、批次是否主导 PC1再进入差异表达。十二、全文速查清单与常见坑位Path B 全流程可按下表自查阶段命令要点关键输出注意0 参考数据gget ref / Ensembl / GENCODEgenome.fa、annotation.gtf、transcripts.fa基因组与 GTF 同 release1 FastQCfastqc -t 8 -o qc/raw reads/*.fq.gzHTML 报告检查接头/rRNA/质量分布2 fastp / Trim Galore见第五节trimmed/*.fq.gz JSON去接头为主勿过度修剪3a STARindex → align --quantMode GeneCountsBAM ReadsPerGene.out.tab--sjdbOverhang读长−1人源 ~30GB RAM3b Salmondecoy index →salmon quant -l Aquant/ /quant.sfgentrome 顺序、k 与读长匹配、查 mapping rate3c featureCounts一次传入全部 BAMfeaturecounts.txt-s与链式一致链式判定Salmon lib_format / RSeQCISR/ISF/IUTruSeq 链式 reverse所有工具对齐4 MultiQCmultiqc qc/ star/ quant/ counts/一份 HTML作为 Methods 的 QC 叙述收口build_counts_matrix.pycounts.csv metadata_template.csv保持基因 × 样本、取整、交由 pydeseq2结合 SKILL.md 的 Common PitfallsPath B 手工执行时最容易翻车的坑是链式设错静默丢一半 reads、不同样本混用比对器/版本/参数与 Path B 逐样本手动执行的特性高度相关、参考/版本未锁定导致结果不可复现以及把 TPM/FPKM 喂给 DESeq2——DESeq2 需要 raw或 length-scaled整数计数装配脚本与取整约定正是为此设计。若需要设计阶段的补课重复数 ≥3、批次与条件勿混杂、设计公式写法请回到 design-and-qc.md若样本量大且想一键复现则应改用 upstream-nfcore.md 描述的 Path A。【免费下载链接】scientific-agent-skillsTurn any AI agent into an AI Scientist. The #1 Agent Skills library for science, used by 190,000 scientists worldwide. 165 ready-to-use validated skills plus 100 scientific databases covering biology, chemistry, medicine, and drug discovery. Compatible with Cursor, Claude Code, Codex, Pi, Antigravity, and the open Agent Skills standard.项目地址: https://gitcode.com/GitHub_Trending/cl/scientific-agent-skills创作声明：本文部分内容由AI辅助生成（AIGC），仅供参考
